腸桿菌和其它非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）20E是經(jīng)典的微量生化鑒定系統(tǒng)，廣泛用于臨床、食品、環(huán)境及科研實(shí)驗(yàn)室對(duì)腸桿菌科及部分非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌的表型鑒定。該系統(tǒng)基于20項(xiàng)生化反應(yīng)的比色或熒光變化，通過(guò)數(shù)值編碼與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)實(shí)現(xiàn)菌種識(shí)別。為確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1. 菌株要求：待測(cè)菌應(yīng)為純培養(yǎng)、18–24小時(shí)新鮮培養(yǎng)物，生長(zhǎng)于非選擇性培養(yǎng)基（如血瓊脂或麥康凱平板），且為革蘭氏陰性桿菌。
2. 試劑與耗材：確認(rèn)API 20E試劑條在有效期內(nèi)，儲(chǔ)存于2–8°C；準(zhǔn)備0.85%無(wú)菌NaCl溶液、礦物油（用于需厭氧反應(yīng)的孔位）及比色卡。
3. 菌液標(biāo)準(zhǔn)化：用無(wú)菌生理鹽水或?qū)Ｓ脩腋∫褐苽渚鷳乙海{(diào)整至0.5 McFarland濁度標(biāo)準(zhǔn)。此濃度是保證反應(yīng)靈敏度與特異性的關(guān)鍵，過(guò)高或過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性。
二、加樣與孵育
1. 加樣操作：
使用接種針或微量移液器，將菌懸液依次注入20個(gè)微孔，每孔加滿，避免氣泡產(chǎn)生。
第21孔（通常為空白對(duì)照或用于后續(xù)補(bǔ)充試驗(yàn)，不加菌液。
2. 礦物油覆蓋：
對(duì)需厭氧環(huán)境的生化反應(yīng)孔，需在加樣后覆蓋1–2滴無(wú)菌礦物油（約50 μL），以隔絕氧氣，促進(jìn)脫羧酶或硫化氫反應(yīng)。具體需加油孔位詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)（通常為孔1–7中的部分孔）。
3. 孵育條件：
將試劑條置于35±2°C恒溫培養(yǎng)箱中孵育18–24小時(shí)。不可縮短時(shí)間（反應(yīng)未完成）或延長(zhǎng)超過(guò)24小時(shí)（可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)）。
三、結(jié)果判讀與編碼
1. 顯色判讀：
孵育結(jié)束后，逐孔觀察顏色變化。多數(shù)反應(yīng)通過(guò)pH指示劑顯色（如黃色=陽(yáng)性，藍(lán)色/綠色=陰性）；H?S反應(yīng)通過(guò)黑色沉淀判斷；IND孔需加入1滴API IND試劑（對(duì)二甲氨基苯甲醛）后觀察紅色環(huán)（陽(yáng)性）。
2. 數(shù)值編碼：
將20項(xiàng)結(jié)果按3-3-3-3-3-3-2分組（共7組），每組陽(yáng)性反應(yīng)賦值，相加得組值，形成7位數(shù)字編碼。
3. 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)：
通過(guò)在線系統(tǒng)或配套軟件輸入編碼，獲取鑒定結(jié)果（包括菌種名稱、T指數(shù)/T%值）。
四、質(zhì)量控制與注意事項(xiàng)
避免交叉污染：每測(cè)試一株菌更換吸頭或接種環(huán)。
不可重復(fù)使用：試劑條為一次性設(shè)計(jì)，禁止部分使用或保存再用。
結(jié)果時(shí)效性：應(yīng)在孵育結(jié)束后2小時(shí)內(nèi)完成判讀，久置可能導(dǎo)致顏色褪變。
結(jié)語(yǔ)
腸桿菌和其它非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）20E作為經(jīng)典的表型鑒定工具，其操作雖看似簡(jiǎn)單，但每一步均影響鑒定準(zhǔn)確性。只有嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程，注重菌液濃度、孵育時(shí)間、顯色判讀等細(xì)節(jié)，并結(jié)合質(zhì)控與數(shù)據(jù)庫(kù)更新，才能充分發(fā)揮其在革蘭氏陰性桿菌鑒定中的價(jià)值。
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